Inducción de un letargo

Nature Metabolism volumen 5, páginas 789–803 (2023) Citar este artículo

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El letargo es un estado de conservación de energía en el que los animales disminuyen drásticamente su tasa metabólica y su temperatura corporal para sobrevivir a las duras condiciones ambientales. Aquí, informamos la inducción no invasiva, precisa y segura de un estado hipotérmico e hipometabólico similar al letargo en roedores mediante estimulación de ultrasonido transcraneal remoto en el área preóptica del hipotálamo (POA). Logramos un estado de letargo de larga duración (> 24 h) en ratones a través del control de retroalimentación de circuito cerrado de la estimulación por ultrasonido con detección automática de la temperatura corporal. La hipotermia y el hipometabolismo inducidos por ultrasonido (UIH, por sus siglas en inglés) se desencadenan por la activación de las neuronas POA, involucran al hipotálamo dorsomedial como una región del cerebro corriente abajo y la subsiguiente inhibición del tejido adiposo marrón termogénico. La secuenciación de ARN de un solo núcleo de las neuronas POA revela que TRPM2 es un canal de iones sensible a los ultrasonidos, cuya eliminación suprime la UIH. También demostramos que la UIH es factible en un animal no tórpido, la rata. Nuestros hallazgos establecen la UIH como una tecnología prometedora para la inducción no invasiva y segura de un estado similar al letargo.

El letargo, como la hibernación, es un estado fisiológico en el que los mamíferos suprimen activamente el metabolismo, reducen la temperatura corporal y ralentizan otros procesos vivos para conservar energía y sobrevivir en condiciones fatales y temperaturas ambientales frías1. El concepto de inducir hipotermia e hipometabolismo similar al letargo por medios artificiales se propuso inicialmente en 1960 como una solución biomédica para reducir el consumo de energía durante los vuelos espaciales tripulados a largo plazo2,3. La hipotermia y el hipometabolismo de tipo letargo también podrían aumentar la probabilidad de supervivencia de los pacientes en condiciones potencialmente mortales (por ejemplo, ataque cardíaco o accidente cerebrovascular) al ralentizar el metabolismo y la progresión de la enfermedad4.

La inducción no invasiva y segura de un estado de letargo se ha considerado ciencia ficción limitada a películas y novelas5,6. A pesar de varias décadas de investigación, todavía no se ha logrado. El concepto original proponía que la hibernación está regulada por sustancias sanguíneas endógenas7 y se dedicaron grandes esfuerzos a buscar sustancias endógenas que indujeran un estado similar al letargo a través de la supresión sistémica del metabolismo8,9. Ahora se cree que el letargo está controlado por el sistema nervioso central (SNC) para coordinar con precisión numerosas funciones10,11,12. Se informó que la inyección intracraneal directa de agentes farmacéuticos dirigidos a las vías del SNC inducía un estado hipotérmico profundo que se asemejaba al letargo natural13,14. Estudios innovadores recientes identificaron varias poblaciones neuronales en el POA hipotalámico que regulan el letargo y la hibernación en roedores11,12,15. La ingeniería genética de estas poblaciones neuronales para la manipulación optogenética y quimiogenética obtuvo características fisiológicas y de comportamiento críticas de letargo/hibernación en ratones11,12,15. Aunque estos avances tecnológicos en la inducción de un estado de letargo son prometedores, estos enfoques requieren intervención quirúrgica o ingeniería genética, lo que limita la amplia aplicación de estos enfoques y la traducción a los humanos.

El ultrasonido es la única forma de energía disponible que puede penetrar el cráneo de manera no invasiva y enfocarse en cualquier lugar dentro del cerebro con precisión milimétrica y sin radiación ionizante16,17. Estas capacidades, junto con su seguridad, portabilidad y bajo costo, han convertido al ultrasonido en una tecnología prometedora para la neuromodulación en animales pequeños18,19, primates no humanos20,21 y humanos16,22, aunque su mecanismo sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, informamos la inducción no invasiva, precisa y segura de un estado similar al letargo en ratones a través de la estimulación remota por ultrasonido en el POA (Fig. 1a). Descubrimos que esta UIH estaba asociada con la activación ultrasónica del canal iónico TRPM2 expresado en las neuronas POA asociadas al letargo. Descubrimos la participación potencial del hipotálamo dorsomedial como una región cerebral posterior y el tejido adiposo pardo como tejido efector en la regulación de la UIH. También demostramos que la estimulación con ultrasonido en POA indujo con éxito hipotermia en ratas, un animal no tórpido.

a, Ilustración de un estado de letargo inducido por ultrasonido (US). b, Ilustración de la sonda portátil de EE. UU. (arriba). La sonda se conectó a una placa base pegada a la cabeza del ratón. La resonancia magnética de la cabeza del ratón con la sonda de EE. UU. portátil muestra que el ultrasonido se dirigió de forma no invasiva al POA (inserto). En la parte inferior se muestra una fotografía de un ratón que se mueve libremente con la sonda de EE. UU. portátil adjunta. c, Ilustración de la forma de onda de estimulación de EE. UU. utilizada en este estudio. ISI, intervalo entre estímulos; PD: duración del pulso; PRF, frecuencia de repetición de pulsos. d, Calibración del aumento de temperatura (T) en la superficie (superior) y en el interior (inferior) de la sonda de EE. UU. La temperatura dentro de la sonda se midió entre el material piezoeléctrico y la cabeza del ratón cuando las sondas de EE. UU. se dirigieron al POA o la corteza. Se seleccionó Cortex como un control fuera del objetivo. La sonicación de EE. UU. se indica mediante las barras rosas. n = 6 ratones (arriba) y n = 4 ratones (abajo). Las líneas continuas y las sombras indican la media ± sem

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El letargo natural se caracteriza por características clave de hipotermia, hipometabolismo e hipoactividad11,23. Diseñamos un transductor de ultrasonido portátil 'plug-and-play' (Fig. 1b y Extended Data Fig. 1) para administrar ultrasonido de forma remota a la región POA de ratones que se mueven libremente y que tenían acceso ad libitum a alimentos y agua. Primero registramos el cambio de temperatura corporal del ratón con una cámara infrarroja térmica y encontramos una disminución profunda en la temperatura de la piel en el área interescapular donde reside el tejido adiposo marrón (BAT) (TBAT) (Fig. 2a y Video complementario 1), durante y después de la estimulación con ultrasonido (1,6 MPa en presión acústica, 3,2 MHz en frecuencia, 50 ms en duración de pulso, 10 Hz en frecuencia de repetición de pulso, 10 s en duración de estímulo, 30 s en intervalo interestímulo y 6 en número total de estímulos; Fig. 1c). Esta observación de una disminución de la temperatura en BAT se sincronizó con un aumento en la temperatura de la cola (Fig. 2a, b). Dos mecanismos principales que subyacen a la termorregulación en roedores son la termogénesis BAT (que permite la producción de calor sin escalofríos) y la vasodilatación de la cola (que permite la disipación de calor). Estos hallazgos indicaron que la estimulación con ultrasonido de POA en ratones suprimió la producción de calor e inició la pérdida de calor para inducir hipotermia. Las grabaciones de video del comportamiento animal mostraron que la estimulación con ultrasonido del POA también se correlacionó con una reducción en la actividad locomotora (Fig. 2b).

a, imágenes térmicas infrarrojas (arriba) y fotos (abajo) de un ratón que recibe estimulación de EE. UU. en POA. La sonda del transductor de EE. UU. está marcada con círculos punteados. b, temperatura BAT (TBAT), temperatura de la cola (Ttail) y actividad física de ratones con estimulación con US en POA (US+, n = 12 ratones) en comparación con dos grupos de control: ratones sin sonicación con US (US–, n = 12 ratones) y ratones con estimulación de EE. UU. en la corteza como control fuera del objetivo (fuera del objetivo, n = 6 ratones). La sonicación de EE. UU. se indica mediante las barras rosas. c, temperatura corporal central (Tcore), tasa metabólica (VO2) y RQ (VCO2/VO2) para US+ (n = 13 ratones para Tcore y n = 17 ratones para VO2 y RQ), US– (n = 14 ratones para Tcore y n = 18 ratones para VO2 y RQ) y grupos fuera del objetivo (n = 4 ratones para Tcore, VO2 y RQ) (arriba, de izquierda a derecha). Max ΔTcore (Tcore más bajo - Tcore medio antes de US), ΔVO2 max (VO2 más bajo - VO2 medio antes de US) y ΔRQ max (RQ más bajo - RQ medio antes de US) (abajo, de izquierda a derecha). Los ratones macho y hembra se representan como puntos azules y rosas, respectivamente. d, Trazos de ECG representativos en ratones antes (arriba) y después de la estimulación con US (abajo). e, Frecuencia cardíaca antes y después de la estimulación con US para los grupos US+ (n = 9 ratones), US– (n = 5 ratones) y fuera del objetivo (n = 5 ratones, dirigidos al hipocampo) (izquierda). No se encontraron diferencias significativas entre el grupo fuera del objetivo y el estadounidense a lo largo de todo el tiempo de registro. Comparación de la frecuencia cardíaca antes de la estimulación con US y la frecuencia cardíaca más baja alcanzada por la estimulación con US en POA dentro de los 10 minutos posteriores a la estimulación con US (derecha). bpm, latidos por minuto. Las líneas sólidas y las sombras indican la media ± sem. Las barras de error indican sem. Cada punto representa un ratón. Los valores de p se calcularon utilizando un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett en c y e (izquierda) comparando los grupos US+ y fuera del objetivo con el grupo US–, respectivamente y una prueba t pareada de dos colas en e (derecha).

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Luego, colocamos a los ratones en jaulas metabólicas, lo que nos permitió evaluar su metabolismo antes, durante y después de la estimulación con ultrasonido del POA analizando las tasas de consumo de oxígeno (VO2) y el cociente respiratorio (RQ = VCO2 / VO2)12. A estos ratones se les implantaron sensores de temperatura inalámbricos en su cavidad abdominal para medir simultáneamente la temperatura corporal central (Tcore). La estimulación con ultrasonido condujo a una marcada disminución de la temperatura corporal central (∆Tcore máx. = −3,26 ± 0,19 °C) (Fig. 2c) y del VO2 (en un 36,61 ± 1,74 %) (Fig. 2c). Estos tamaños de efecto fueron similares al letargo inducido por ayuno informado previamente en ratones11,24. El ultrasonido suprimió el consumo de oxígeno antes de la caída de la temperatura corporal (Datos ampliados Fig. 2b, c), lo que sugiere una inhibición activa del metabolismo en lugar de un efecto secundario de la hipotermia. La duración de la reducción de Tcore por debajo de la temperatura corporal fue de 51,98 ± 5,52 min por UIH (datos extendidos Fig. 2d), que fue comparable al letargo natural24,25. La ecografía también disminuyó el RQ a 0,72 ± 0,01 (fig. 2c). Un RQ cercano a 0,7 indica que la UIH cambió la utilización de sustratos energéticos de una mezcla de carbohidratos y grasas a una dependencia de la oxidación de grasas, que se ha establecido como una característica común de los animales aletargados26. Los ratones sometidos a UIH espontáneamente pasaron del estado hipotérmico e hipometabólico a una condición normal, que también es una característica crítica del letargo natural5,11,12. Los registros de electrocardiograma (ECG) mostraron que la UIH disminuyó la frecuencia cardíaca en un 47,3%, que fue significativamente más baja que antes de la estimulación con ultrasonido y el grupo sin estimulación con ultrasonido (Fig. 2d, e). Estos estados fisiológicos no se observaron en ratones sin estimulación con ultrasonido o con estimulación con ultrasonido en ubicaciones fuera del objetivo (corteza e hipocampo ventral) (Fig. 2b-e y Datos extendidos Fig. 3), verificando que el estado de letargo inducido por ultrasonido fue evocado por estimulación específica de POA, en lugar de efectos no específicos, como el calor producido por material piezoeléctrico de ultrasonido (Fig. 1d). El examen de inmunohistología de los cerebros de los ratones después del tratamiento con ultrasonido no encontró ningún daño o inflamación visible dentro del cerebro (Datos extendidos Fig. 4). Todos los experimentos anteriores se realizaron a temperatura ambiente (~22 °C). Repetimos el experimento a temperatura ambiente fría (6 °C) y termoneutral (30 °C) y descubrimos que la hipotermia y el hipometabolismo se provocaron con éxito (Datos extendidos Fig. 5). El tamaño del efecto de la UIH aumentó a medida que disminuyó la temperatura ambiente (datos ampliados, figura 5), ​​lo que sugiere que el efecto de la UIH podría estar modulado por la temperatura ambiente.

Luego investigamos la capacidad del ultrasonido para controlar con precisión la profundidad y duración de la hipotermia. Esta capacidad de controlar con precisión el estado inducido es la clave para diseñar con éxito el estado de letargo. El efecto del ultrasonido en el cerebro depende de muchos parámetros, incluida la presión acústica y la duración del estímulo. Observamos que la mayor presión acústica y la duración del estímulo aumentaron la profundidad de la UIH, medida por el ∆TBAT máximo (Fig. 3a, b). Se necesitó una presión acústica superior a 0,8 MPa para provocar un cambio significativo en ∆TBAT bajo el espacio de parámetros probado en este estudio. Desarrollamos un controlador automático de retroalimentación de circuito cerrado para lograr una UIH estable y de larga duración mediante el control binario de la salida de ultrasonido. Como prueba de concepto, el controlador de retroalimentación de circuito cerrado fijó la temperatura corporal deseada (Tset) en menos de 34 °C, lo que se informó anteriormente como un criterio para el letargo natural en ratones27 (Fig. 3c). El controlador recibió continuamente señales de entrada del sensor de temperatura corporal central y luego encendió la estimulación de ultrasonido cuando Tcore > Tset o se apagó cuando Tcore ≤ Tset. La temperatura corporal central se registró durante una duración total de 30 horas y el procedimiento de ultrasonido controlado por retroalimentación continuó durante 24 horas. Los resultados mostraron que la UIH controlada por retroalimentación mantuvo la temperatura corporal del ratón a 32,95 ± 0,45 ° C durante aproximadamente 24 h (24,90 ± 0,63 h) (Fig. 3d, e). Los ratones mostraron una ingesta de alimentos reducida y pérdida de peso con UIH controlada por retroalimentación en comparación con los controles (Fig. 3f). La temperatura corporal del ratón se recuperó gradualmente a un nivel normal (> 34 ° C) a los 54,18 ± 35,56 min después de que finalizó la UIH controlada por retroalimentación (Datos extendidos Fig. 2e). El sistema de control de retroalimentación de circuito cerrado revela el gran potencial de la tecnología de interfaz de ultrasonido-cerebro para la inducción precisa y no invasiva de UIH.

a, TBAT medido con estimulación US a diferentes presiones acústicas (izquierda) y duración del estímulo (derecha). Las líneas sólidas y las sombras en las curvas indican la media ± sem b, las correlaciones entre ΔTBAT máx. (TBAT más baja - TBAT media antes de US) y la presión acústica (izquierda) o la duración del estímulo (derecha). n = 4 ratones para los grupos de 0,4 MPa, 1,2 MPa, 2 s, 4 s y 6 s; n = 7 para los grupos 0-MPa y 0-s; n = 3 para los grupos de 0,8 MPa y 8 s y n = 6 para los grupos de 1,6 MPa y 10 s). Las barras de error denotan sem c, Ilustración esquemática del sistema de control de retroalimentación de circuito cerrado para lograr una UIH de larga duración (creado con BioRender.com). d, Tcore representativo medido en un ratón con la UIH controlada por retroalimentación de circuito cerrado. Cada estímulo estadounidense está representado por un punto rosa. e, Cuantificación de la Tcore media (izquierda) y la duración cuando Tcore < 34 °C (derecha) lograda por el sistema de control de retroalimentación de circuito cerrado. f, Ingesta de alimentos (izquierda) y cambio de peso corporal (derecha) de los ratones que se sometieron a UIH controlada por retroalimentación de circuito cerrado (US+, n = 4 ratones), en comparación con los ratones de control (US−, n = 4 ratones). Para los diagramas de caja, la línea central y los límites de la caja indican que la media ± sem Los valores de P se calcularon usando una prueba t no pareada de dos colas.

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Para comprender el mecanismo neuronal de la UIH, comenzamos con la hibridación in situ con fluorescencia ex vivo (FISH) y la tinción de inmunofluorescencia del marcador de actividad neuronal Fos en la región POA dirigida por ultrasonido (Fig. 4a y Datos extendidos Fig. 6). La expresión de Fos fue alta en el área preóptica media (MPA; 10,17 ± 1,30 % frente a 1,85 ± 0,69 %), núcleo preóptico medial (MPO; 7,58 ± 0,51 % frente a 1,38 ± 0,57 %) y núcleo periventricular (Pe; 6,68 ± 1,39 %). frente a 1,43 ± 0,82%) (fig. 4b). Luego estudiamos la dinámica de la actividad neuronal en el POA en respuesta al ultrasonido. Expresamos el reportero de calcio (Ca2+) GCaMP6s en neuronas POA, instalamos una fibra óptica en la misma región y registramos continuamente la dinámica de la actividad de Ca2+ antes, durante y después de la estimulación por ultrasonido usando fotometría de fibra (Fig. 4c). Observamos un aumento consistente, robusto y repetido en la actividad neuronal en respuesta a cada pulso de ultrasonido (Fig. 4d). La actividad neuronal registrada durante la estimulación con ultrasonido se caracterizó por un aumento en la amplitud máxima (de 0,17 ± 0,30 a 2,03 ± 0,42), la puntuación z media (de 0,09 ± 0,28 a 1,69 ± 0,40) y la frecuencia máxima (de 0 a 5,7 ± 1,08). min-1) en comparación con la actividad neuronal medida antes de la estimulación con ultrasonido (Fig. 4e). La tendencia de los cambios en la actividad de Ca2+ se alineó con la tendencia de los cambios en la temperatura corporal (Fig. 4d). Estos hallazgos revelaron que la UIH fue provocada por la activación por ultrasonido de las neuronas POA. Nuestro hallazgo de que la estimulación transcraneal del POA fue suficiente para inducir la UIH reveló el papel crítico del POA en la orquestación de un estado similar al letargo en ratones.

a, Arriba: análisis de hibridación in situ del marcador Fos en la región POA en ratones con (US+) y sin (US–) estimulación con US. El inserto muestra la región del cerebro donde se obtuvieron estas imágenes. Distribución espacial de la señal de Fos registrada con el atlas de cerebro de ratón (abajo). LPO, área preóptica lateral; VLPO, núcleo preóptico ventrolateral; VMPO, núcleo preóptico ventromedial. b, Fracción de células Fos+ en diferentes regiones cerebrales POA en los grupos US+ y US–. n = 6 ratones para el grupo US+ y n = 4 ratones para el grupo US-, con la excepción de la cuantificación de VLPO en el grupo US+ donde se utilizaron n = 5 ratones. Las barras de error denotan sem c, Ilustración esquemática para el registro de fotometría de fibra de la actividad de Ca2+ neuronal en el POA objetivo de los EE. UU. (creado con BioRender.com) (izquierda). La resonancia magnética de un ratón muestra la alineación confocal de la fibra óptica (línea de puntos verde) y el transductor de ecografía (marrón) en la región POA (derecha). d, actividades representativas de Ca2+ (arriba) de las neuronas POA que reciben estimulación de EE. UU. y la curva TBAT correspondiente (abajo). La estimulación US se compone de seis estímulos individuales. e, señal de Ca2+ en respuesta a cada pulso de EE. UU. de n = 7 ratones. Con base en esta señal de Ca2+, se cuantificaron la amplitud máxima, la puntuación z media y la frecuencia en tres ventanas antes (5 s), durante (10 s) y después (15 s) de la estimulación con US (n = 7 ratones). Para los diagramas de caja, la línea central y los límites de la caja indican la media ± sem Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de dos colas no pareada (b) y la prueba t de dos colas pareada (e).

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Para identificar la molécula sensible al ultrasonido que permite la activación de las neuronas POA asociadas con la inducción de UIH (neuronas POAUIH), realizamos una secuenciación de ARN de núcleo único de alto rendimiento (snRNA-seq) de la región POA dirigida por ultrasonido. Diseccionamos las regiones POA (n = 4 ratones para el grupo US+ y n = 4 ratones para el grupo US- simulado), las disociamos para recolectar núcleos individuales y preseleccionar núcleos de neuronas usando el marcador NeuN. Se identificó un total de 35 grupos neuronales diversos que contenían 21 886 neuronas (Fig. 5a) utilizando un agrupamiento basado en gráficos no supervisado28. Entre ellos, 11 grupos son excitatorios (incluidos 2 grupos híbridos) y 24 son inhibitorios (incluidos 3 grupos híbridos) (Fig. 5b), lo que es consistente con la gran diversidad de tipos de células en el POA11,29. Estudios recientes identificaron que las neuronas asociadas al letargo se caracterizan por marcadores genéticos específicos, incluidos Adcyap1 (que codifica el polipéptido activador de la adenilato ciclasa-1)11, Qrfp (péptido RFamida piroglutamilado)12 y Esr1 (receptor de estrógeno-1)15. Además, la mayoría de estas neuronas se clasificaron como excitatorias o híbridas. Utilizamos estos tres marcadores para identificar las neuronas asociadas al letargo mediante la realización de agrupaciones de k-means30 y encontramos siete grupos asociados al letargo que eran neuronas excitatorias o híbridas (Fig. 5b).

a, Gráfico de proyección y aproximación de colector uniforme (UMAP) de 21.886 núcleos neuronales. Diferentes colores representan diferentes poblaciones neuronales. Los niveles de expresión de tres genes principales representativos de marcadores específicos de clase están codificados por colores (azul) en UMAP: Gad1 para grupos inhibitorios, Slc17a6 para grupos excitatorios y Adcyap1+ para grupos asociados a letargo. b, Expresión de genes marcadores excitatorios e inhibidores en diferentes tipos de células neuronales (organizados por agrupación de k-medias) (arriba). Expresión de genes marcadores asociados al letargo (Adcyap1, Esr1 y Qrfp) en poblaciones neuronales híbridas y excitatorias (agrupadas en función de estos genes asociados al letargo) (centro). Expresión de todos los genes que codifican familias de canales TRP y PIEZO en todos los grupos asociados al letargo, que se clasificaron según el nivel de expresión de los IEG (abajo). La barra rosa indica el grupo que fue activado por EE.UU. c, El nivel de expresión de Trpm2 está codificado por colores (azul) en UMP. El grupo h0 asociado al letargo activado por EE. UU. está etiquetado en la gráfica. d, imagen FISH representativa de Adcyap1 y Trpm2 en la región POA de dos secciones coronales de diferentes niveles. Los análisis FISH se repitieron en cinco ratones. Las coordenadas anterior-posterior relativas a bregma se indican en base al Allen Mouse Brain Atlas62.

La hipótesis comúnmente aceptada para la neuromodulación por ultrasonido es la activación de canales iónicos endógenos sensibles al ultrasonido. Aunque estudios previos reportaron la activación de varios canales iónicos de las familias PIEZO y TRP (incluyendo PIEZO1/2 (refs. 31,32), TRPA1 (ref. 33), TRPV1 (ref. 34), TRPP1/2 y TRPC1 (ref. 35), estos estudios se realizaron principalmente in vitro utilizando células cultivadas. No se ha realizado ningún estudio in vivo para seleccionar canales iónicos candidatos para revelar los canales iónicos sensibles al ultrasonido en las neuronas del cerebro. Aquí, examinamos todos los genes de TRP (TRPV, TRPM, TRPC, TRPP, TRPA y TRPML) y familias de canales PIEZO en las neuronas excitatorias asociadas al letargo y encontramos una amplia expresión de genes que codifican familias de canales TRP, incluidos TRPV, TRPM, TRPC , canales iónicos TRPA y PIEZO (Fig. 5b). Entre las siete poblaciones neuronales asociadas con el letargo, identificamos una población específica que se caracterizó por una alta expresión de cinco marcadores de activación neuronal, incluidos Fos, Fosb, Nr4a1, Egr1 y Dusp1, también conocidos como genes tempranos inmediatos (IEG), lo que indica que esta población neuronal fue activada por ultrasonido. Nos referimos a las neuronas POAUIH de la población neuronal asociada al letargo activado por ultrasonido. Al evaluar todos los genes de los canales TRP y PIEZO, encontramos que el nivel de expresión de TRPM2 era alto en las neuronas POAUIH (Fig. 5b, c).

Para verificar que el canal iónico TRPM2 es sensible al ultrasonido, realizamos un análisis FISH ex vivo y encontramos que Trpm2 se coexpresaba con Fos, con un porcentaje de coexpresión de 27.53 ± 9.75% (Fig. 6a, b). Luego evaluamos más la sensibilidad al ultrasonido de TRPM2 al sobreexpresarlo en células HEK293T. Descubrimos que el ultrasonido indujo con éxito la entrada de Ca2 + en células que sobreexpresan TRPM2, lo que no se observó en las células de tipo salvaje (Fig. 6c, d). La respuesta de Ca2+ provocada por ultrasonido en las células TRPM2+ fue significativamente suprimida por el bloqueador de TRPM2 2-APB (Fig. 6c, d). Estos hallazgos respaldan firmemente que TRPM2 es un canal iónico sensible a los ultrasonidos.

a, Imágenes FISH representativas de Fos y Trpm2. Las células que coexpresan Fos y Trpm2 están encerradas en un círculo. b, El porcentaje de células Fos+ en poblaciones que expresan Trpm2 (Trpm2+) en comparación con la población que carece de expresión de Trpm2 (Trpm2-). n = 4 ratones. c, Imágenes de fluorescencia Ca2+ de células HEK293T in vitro sin sobreexpresión de TRPM2 (izquierda), con sobreexpresión de TRPM2 (centro) y con sobreexpresión de TRPM2 y bloqueador 2-APB (derecha). Antes de la estimulación con US (arriba); después de la estimulación de EE. UU. (abajo). n = 5 pruebas independientes. WT, tipo salvaje. d, Mapa de calor de la señal de Ca2+ normalizada (ΔF/F) de 100 células seleccionadas al azar de cinco pruebas independientes en estos tres grupos. Las líneas punteadas indican el tiempo de activación y desactivación de la estimulación ecográfica. e, ΔTBAT (cambio de TBAT en relación con la línea de base) de ratones inyectados con shRNA para eliminar TRPM2 (TRPM2-KD) (izquierda). El ΔTBAT máximo (derecha) se determinó como el ΔTBAT más bajo durante el intervalo de 7 a 12 minutos después del inicio de la estimulación con US, según el gráfico de la izquierda. El grupo simulado recibió una inyección de shRNA codificado. n = 5 ratones para el grupo simulado y n = 7 ratones para el grupo TRPM2-KD. f, señal de Ca2+ en respuesta a la sonicación de EE. UU. (barra rosa) en ratones TRPM2-KD en comparación con el grupo simulado. La amplitud máxima de la curva de Ca2+ se cuantificó para el grupo TRPM2-KD y el grupo simulado. n = 8 ratones para el grupo simulado y n = 10 ratones para el grupo TRPM2-KD. Las líneas sólidas y las sombras en las curvas indican la media ± sem. Las barras de error indican que la estimulación ecográfica sem está marcada con barras rosas. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos colas no pareada en b y e. Se usó la prueba t de dos colas pareadas en f al comparar la amplitud máxima antes y durante la estimulación con EE. UU.

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Para verificar que el canal iónico TRPM2 está involucrado en la UIH, realizamos un análisis de hibridación in situ y encontramos que Trpm2 se colocalizó con el marcador molecular de neuronas asociadas al letargo Adcyap1 con un porcentaje de coexpresión de 35.7 ± 5.3% (Fig. 5d). Investigamos más a fondo los roles de TRPM2 en UIH mediante el uso de lentivirus-shRNA para eliminar específicamente los niveles de expresión de TRPM2 (TRPM2-KD) en la región POA. El análisis de transferencia Western confirmó la eliminación exitosa de TRPM2 (Datos extendidos Fig. 7). Los ratones TRPM2-KD redujeron significativamente la UIH. La reducción de la temperatura TBAT se redujo en un 41,2% en ratones TRPM2-KD en comparación con el control (Fig. 6e). La amplitud de la señal de Ca2+ evocada por ultrasonido en POA disminuyó hasta casi la línea de base en ratones TRPM2-KD (Fig. 6f). Estos hallazgos demostraron que TRPM2 estaba involucrado en la inducción de UIH.

Luego estudiamos las posibles regiones cerebrales aguas abajo asociadas con la activación de las neuronas POA durante la UIH. Se informó anteriormente que las regulaciones metabólicas y térmicas están coordinadas por proyecciones POA al hipotálamo dorsomedial (DMH)36,37, núcleo arqueado (ARC)36 e hipotálamo ventromedial (VMH)36, que se encuentran en la región hipotalámica posterior al POA. Realizamos el análisis FISH del marcador Fos en estas regiones hipotalámicas después de la estimulación con ultrasonido en el POA. Detectamos una mayor expresión de Fos en múltiples áreas hipotalámicas, incluidas DMH, ARC y el hipotálamo lateral (LH) (Fig. 7a, b). La expresión más alta de Fos se observó en DMH (6,00 ± 0,91 % en EE. UU.+) (Fig. 7b). Registramos la señal de Ca2+ en la región de DMH usando fotometría de fibra mientras enfocamos simultáneamente el ultrasonido en el POA para estudiar la actividad neuronal de DMH durante la UIH ( Figura 7c). Observamos que la amplitud máxima media de la señal de Ca2+ de las neuronas DMH aumentó durante la estimulación con ultrasonido en el POA (de 0,04 ± 0,20 a 0,41 ± 0,15; Fig. 7d, e), lo que demuestra que la activación de las neuronas DMH está asociada con la UIH . Estos resultados indicaron que DMH está potencialmente involucrado en el circuito neuronal que regula UIH, mientras que otras regiones del cerebro (por ejemplo, ARC y VMH) también pueden actuar como nodos en la red neuronal de letargo.

a, tinción FISH del marcador Fos en regiones hipotalámicas alrededor de DMH en ratones con (US+) y sin (US–) estimulación US (izquierda). Las ubicaciones de estas imágenes se indican en el atlas del cerebro (inserto). Distribución espacial de la señal de Fos registrada en el atlas de cerebro de ratón (derecha). TU, tubérculo olfatorio. b, Fracción de células Fos+ en DMH, ARC, LH, VMH y TU para ratones US+ y US–. n = 5 ratones para el grupo US+ y n = 4 ratones para el grupo US−. Las barras de error denotan sem c, Configuración para el registro de fotometría de la actividad de Ca2+ neuronal en el DMH simultáneamente con la orientación de US en el POA. d, actividad de Ca2+ de las neuronas DMH durante la estimulación de las neuronas POA por EE. UU. n = 5 ratones. Las líneas sólidas y las sombras en las curvas indican la media ± sem e, la amplitud máxima (izquierda), la puntuación z media (centro) y la frecuencia (derecha) de la actividad neuronal de DMH antes, durante y después de la estimulación con US en la región POA. n = 5 ratones. f, Ilustrativo de la hipótesis de que la UIH está mediada por la termogénesis y el gasto de energía de BAT dependientes de UCP1. g, Tcore durante la estimulación de EE. UU. Comparando ratones WT y UCP1-knockout (UCP1-KO) (izquierda). Max ΔTcore (Tcore más bajo - Tcore medio antes de EE. UU.) (derecha). h, VO2 durante la estimulación con US en ratones WT y UCP1-KO (izquierda). Max ΔVO2 (VO2 más bajo - VO2 medio antes de la estimulación con ultrasonido) (derecha). En g y h, las líneas sólidas y las sombras en las curvas indican la media ± sem; las barras de error denotan sem; n = 6 ratones para el grupo WT y n = 5 ratones para el grupo UCP1-KO. El valor de p se calculó utilizando la prueba t de dos colas no pareadas (b, g, h) y la prueba t de dos colas pareadas (e). c y f fueron creados con BioRender.com.

Datos fuente

Se sabe que el hipotálamo está conectado con el sistema nervioso simpático que altera la termogénesis y el gasto energético de los tejidos efectores periféricos38. Observamos la disminución de la temperatura de BAT durante UIH (Fig. 2a, b), lo que indica que BAT es un tejido efector aguas abajo de los circuitos neuronales de UIH (Fig. 7f). Como UCP1 es la proteína mitocondrial crucial responsable de la termogénesis de BAT39, usamos ratones UCP1-KO para UIH y comparamos los cambios en Tcore y VO2 con los del control de tipo salvaje. Encontramos que la profundidad de la hipotermia inducida por ultrasonido (medida por el ΔTcore máximo) fue ~ 2.2 veces menor en ratones UCP1-KO que en ratones de tipo salvaje (Fig. 7g). El grado de hipometabolismo (medido por ΔVO2 máximo) fue 1,7 veces menor en ratones UCP1-KO que en ratones de tipo salvaje (Fig. 7h); sin embargo, este estado hipotérmico e hipometabólico no se eliminó por completo en los ratones UCP1-KO. Estos hallazgos confirmaron que BAT es un tejido efector que media los cambios en la temperatura corporal y la tasa metabólica durante la UIH.

Los ratones están bien equipados para entrar en un estado de letargo bajo restricción calórica. Para evaluar si se puede evocar la HI en animales no tórpidos, realizamos estimulación con ultrasonido en ratas, una especie que no muestra ni hibernación ni letargo diario12,14. El ultrasonido se administró de forma remota a la región POA de ratas que se movían libremente utilizando el transductor de ultrasonido portátil con un diseño similar al utilizado en ratones (Fig. 1b). Encontramos una disminución en la temperatura de la piel, particularmente en la región BAT (TBAT) después de la estimulación con ultrasonido (Fig. 8a, b). La estimulación con ultrasonido también indujo una disminución significativa en la temperatura corporal central (∆Tcore máx. = -1,33 ± 0,22 °C) en ratas (Fig. 8c). Aunque el grado de reducción de la temperatura corporal fue menor en ratas que en ratones, estos datos demuestran la viabilidad de la UIH en un animal no tórpido.

a, Imágenes térmicas infrarrojas de una rata que recibe estimulación de EE. UU. en el POA. b, TBAT de ratas que recibieron sonicación en el POA (US+, n = 12) en comparación con las ratas de control sin estimulación con US (US–, n = 4). c, curvas Tcore en los grupos US+ (n = 6) y US– (n = 6) (izquierda). Comparación del ΔTcore máximo entre los grupos US+ y US– (derecha). Las líneas sólidas y las sombras en las curvas indican la media ± sem. Las barras de error indican sem. El valor de P se calculó utilizando una prueba t no apareada de dos colas.

Datos fuente

En este estudio, desarrollamos la técnica UIH que indujo de manera no invasiva, precisa y segura un estado de letargo en ratones. Revelamos que la UIH fue evocada por la activación por ultrasonido de las neuronas POA. Las neuronas POAUIH tenían una alta expresión del canal iónico TRPM2, que resultó ser sensible a los ultrasonidos y contribuyó a la inducción de UIH. Además, nuestros hallazgos indican la participación potencial del hipotálamo dorsomedial como una región cerebral aguas abajo y el tejido adiposo pardo como tejido efector en la UIH. Demostramos que la estimulación con ultrasonido en POA provocó un estado de hipotermia en un animal no aletargado (rata).

Nuestros hallazgos demostraron que la estimulación con ultrasonido del POA suprimió globalmente los procesos fisiológicos de una manera que se asemejaba al letargo natural. La estimulación con ultrasonido suprimió sistémicamente el metabolismo y la termogénesis, cambió la utilización de sustratos energéticos a grasas y disminuyó la frecuencia cardíaca, que en conjunto son características clave del letargo natural11,23. Se encontró que la estimulación única con ultrasonido induce un estado hipotérmico e hipometabólico que dura aproximadamente 1 hora, lo cual es consistente con el letargo natural24,25. Esta duración prolongada también fue consistente con un informe anterior que encontró que la activación optogenética de las neuronas QRFP en el POA resultó en un estado de hipotermia que duró más de 30 minutos después de una iluminación de luz de 1 segundo. La duración relativamente prolongada de este estado se atribuye en parte al lento proceso de termogénesis durante el recalentamiento40. También podría ser posible que los circuitos neuronales involucrados en el mantenimiento de este estado hipotérmico e hipometabólico puedan ser activados por estimulación ultrasónica directa o indirectamente. A pesar de la similitud entre la UIH y el letargo natural, todavía existen diferencias entre estos dos estados con respecto a los tejidos efectores aguas abajo. Encontramos que BAT está involucrado en el proceso de UIH mediado por UCP1 que regula tanto la profundidad de la hipotermia y el hipometabolismo como la activación de UIH (Datos extendidos Fig. 8). Sin embargo, en el letargo natural, se informó que UCP1 contribuye principalmente a despertar del letargo, no a la profundidad de la hipotermia y el hipometabolismo40. Además, la temperatura de la cola del ratón aumentó durante la UIH, posiblemente para mejorar la disipación térmica a través de la vasodilatación. Este fenómeno no se informó en el letargo diario inducido por el ayuno41. Se necesita investigación adicional para caracterizar y comprender las similitudes y diferencias entre el estado UIH y el letargo natural con respecto a las características fisiológicas, los circuitos neuronales y los tejidos efectores.

La regulación globalmente coordinada de los comportamientos asociados al letargo infiere que el ultrasonido moduló las poblaciones neuronales asociadas al letargo en POA. De hecho, la secuenciación de ARN de un solo núcleo reveló que el ultrasonido activó las poblaciones neuronales asociadas al letargo informadas anteriormente en POA, que se caracterizan por los genes marcadores de Adcyap1, Qrfp y Esr1 (refs. 11, 12, 15). Descubrimos que TRPM2 es un canal iónico sensible al ultrasonido en las neuronas POAUIH. Nuestro estudio proporciona evidencia in vivo que revela que el ultrasonido modula las actividades neuronales en el cerebro al activar los canales iónicos endógenos. TRPM2 se descubrió previamente en neuronas POA sensibles al calor que regulan la temperatura corporal42. Encontramos que TRPM2 es necesario para inducir UIH. Este estudio se centró en TRPM2, que fue el canal iónico expresado más alto en las neuronas POAUIH entre los canales iónicos incluidos en nuestro análisis. Además de TRPM2, también observamos una amplia expresión de otras familias de canales TRP y PIEZO en poblaciones neuronales asociadas al letargo. La caída de TRPM2 suprimió parcialmente la profundidad de la UIH pero no eliminó por completo el efecto de la UIH, lo que sugiere que otros canales iónicos o moléculas sensibles al ultrasonido también están involucrados en la activación ultrasónica de las neuronas POA para inducir hipotermia e hipometabolismo.

Quedan por descubrir los mecanismos biofísicos para la activación por ultrasonido de las neuronas POA y el canal iónico TRPM2. TRPM2 es un canal catiónico no selectivo, permeable al Ca2+ y sensible a los cambios de temperatura43,44. Medimos la temperatura del POA durante la sonicación por ultrasonido utilizando termometría de imágenes por resonancia magnética (IRM) in vivo. El aumento de temperatura en el POA fue de 2,58 ± 0,26 °C (datos ampliados, figura 9), lo que sugiere que el efecto térmico inducido por ultrasonido contribuyó a la activación de las neuronas del POA. Al analizar la correlación de la activación neuronal y el aumento de la temperatura del POA, encontramos que el tiempo medio de inicio de la activación neuronal fue de 1,17 s. El aumento medio de la temperatura en el momento de inicio de la activación neural fue de 0,06 °C (datos ampliados, figura 9). Un aumento de temperatura tan bajo sugiere que el efecto mecánico (no térmico) inducido por ultrasonido también contribuyó a la activación de las neuronas POA. De manera similar, observamos un aumento de temperatura en la cámara de cultivo celular durante la estimulación con ultrasonido de las células TRPM2+ HEK293. Descubrimos que el aumento medio de la temperatura correspondiente al inicio de la actividad de Ca2+ de las células TRPM2+ fue de 0,34 °C (Datos ampliados, Fig. 10). En resumen, es probable que las neuronas POA y el canal iónico TRPM2 se activen por los efectos mecánicos y térmicos del ultrasonido.

Las neuronas POA coordinan la activación de varias áreas cerebrales posteriores para orquestar el letargo; sin embargo, este circuito complejo de todo el cerebro aún se desconoce en gran medida. Encontramos que la inducción de UIH se correlacionó con la activación de las neuronas DMH durante la estimulación ultrasónica en el POA. Este hallazgo es consistente con los circuitos neuronales informados previamente que las neuronas POA asociadas con el letargo Qrfp y Adcyap1 se proyectan a DMH para inducir hipotermia e hipometabolismo durante el letargo inducido genéticamente o inducido por el ayuno11,12. Nuestro estudio también sugiere que otras regiones del cerebro aguas abajo, como el ARC, también pueden estar involucradas en la coordinación de la UIH. Se sugirió que el ARC, un área en el hipotálamo que es fundamental para la regulación de la homeostasis energética, es la región crucial aguas abajo que recibe la proyección de las neuronas Esr1+ que inducen letargo en POA15. Estos hallazgos sugieren que la estimulación con ultrasonido induce hipotermia e hipometabolismo similares a los de un letargo mediante la modulación de los circuitos neurales involucrados en el letargo natural. Este estudio también encontró que el tejido efector aguas abajo, BAT, estaba involucrado en la regulación de UIH. BAT se estudió previamente en el contexto de la termogénesis39,45, mientras que su papel en la regulación del letargo no se exploró por completo40,46,47. Descubrimos que BAT es uno de los tejidos efectores clave que median los cambios en la temperatura corporal y la tasa metabólica durante la UIH y que estos efectos dependen de UCP1.

La UIH tiene el potencial de abordar el objetivo buscado durante mucho tiempo de lograr una inducción no invasiva y segura del estado de letargo, que ha sido perseguido por la comunidad científica al menos desde la década de 1960. En el pasado, se dedicaron grandes esfuerzos a identificar agentes farmacológicos que supriman sistémicamente el metabolismo e induzcan un estado similar al letargo. Estos agentes, como el sulfuro de hidrógeno9, el monofosfato de adenosina48, los delta-opioides49, la N6-ciclohexiladenosina14,50 y los cócteles de compuestos químicos51, carecen de especificidad anatómica y funcional e inducen efectos secundarios sistémicos fuera del objetivo52, todo lo cual limita sus usos. Estudios recientes propusieron enfoques para inducir el letargo dirigiéndose al SNC mediante la inyección quirúrgica de agentes farmacéuticos en el cerebro o la ingeniería genética de los circuitos neuronales asociados al letargo. Estos enfoques son de vital importancia para investigar la vía nerviosa central del letargo, pero las necesidades de intervención quirúrgica en el cerebro y la ingeniería genética limitan su traducción a los humanos. En comparación con otras técnicas de neuromodulación no farmacológicas y no genéticas (por ejemplo, estimulación cerebral profunda, estimulación magnética transcraneal y estimulación de corriente continua transcraneal), la estimulación por ultrasonido posee una capacidad única para llegar de manera no invasiva a regiones profundas del cerebro con alta precisión espacial y temporal en animales. y cerebros humanos. La UIH utiliza la estimulación por ultrasonido transcraneal para inducir hipotermia e hipometabolismo mediante la estimulación no invasiva del principal regulador del letargo, el POA. Representa una técnica no invasiva y segura que induce hipotermia e hipometabolismo similares a letargo al dirigirse al SNC.

Como ya se ha demostrado que la neuromodulación por ultrasonido es factible en humanos, la UIH es una excelente promesa para traducir a humanos. Una pregunta válida es si la UIH se puede extrapolar de ratones a humanos. Demostramos que la estimulación con ultrasonido indujo hipotermia en ratas, que no entran naturalmente en letargo, lo que sugiere la posibilidad de que se puedan inducir efectos similares en humanos. La regulación ultrasónica precisa de las neuronas POA puede lograr hipotermia e hipometabolismo similares a letargo en los seres humanos, aunque es necesario realizar mucho trabajo. UIH puede desbloquear aplicaciones que van desde nuevos tratamientos médicos hasta vuelos espaciales tripulados de larga duración.

Para la caracterización inicial del efecto de hipotermia e hipometabolismo similar al letargo inducido por EE. UU., utilizamos ratones C57BL/6NCrl machos y hembras adultos (de 6 a 9 semanas de edad) (Charles River Laboratories) que se asignaron aleatoriamente a grupos experimentales. El laboratorio de J. Brestoff proporcionó ratones knockout para UCP1 (hembra, de 2 a 4 meses de edad). En este estudio se utilizaron ratas Wistar Han IGS hembras y machos (Charles River Laboratories, código de cepa 273) a la edad de 4 a 6 semanas. Todos los ratones y ratas se alojaron en una instalación para animales en la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los animales se mantuvieron en un ambiente de temperatura controlada (23-26 °C) y humedad controlada (35-65%), con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y se les proporcionó una dieta de comida estándar. Todos los estudios en animales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington en St. Louis de acuerdo con las Directrices para la Investigación Animal de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (protocolo animal n.º 21-0187).

Diseñamos transductores portátiles miniaturizados de EE. UU. para proporcionar estimulación de EE. UU. en ratones que se mueven libremente. El transductor se fabricó utilizando un resonador cerámico de titanato de circonato de plomo (DL-43, DeL Piezo Specialties) con una frecuencia central de 3,2 MHz, una apertura de 13 mm y una profundidad focal geométrica de 10 mm. Cada transductor fue calibrado por un hidrófono (HGL-200, Onda) en agua desionizada y desgasificada con y sin cráneo de ratón ex vivo. El ancho total a la mitad del máximo del transductor de EE. UU. fue de 0,8 mm y 3,8 mm en las direcciones lateral y axial, respectivamente.

El transductor de EE. UU. portátil se adjuntó a la cabeza del ratón mediante el diseño 'enchufable' en una placa base que se pegó en el cráneo del ratón antes del experimento (Datos extendidos Fig. 1). Para pegar la placa base, se anestesió al ratón y se fijó la cabeza con un marco estereotáctico. Se adjuntó un rotulador al marco estereotáctico y se usó para dibujar un punto en el cráneo para indicar la región POA usando sus coordenadas en referencia al bregma (AP = 0,2 mm y ML = 0,2 mm en relación con el bregma). La placa base se implantó en la parte superior del cráneo del ratón con la ayuda de un inserto. El inserto tenía un agujero en el centro, que estaba alineado con el punto en el cráneo para apuntar a la región cerebral deseada. Después de este proceso de focalización, se retiró el inserto y se pegó la placa base al cráneo con cemento adhesivo. Para el experimento de control fuera del objetivo, se implantó la placa base para apuntar a la corteza (AP = 3,0 mm y ML = 0 mm, en relación con bregma) o el hipocampo ventral, que se encuentra a la misma profundidad que POA (AP = −2,7 mm, ML = 2,7 mm y DV = −5,0 mm). Después de la implantación de la placa base, se permitió que los animales se recuperaran de la cirugía y se adaptaran a la placa base durante al menos 3 días. Antes de cada experimento de estimulación de EE. UU., el transductor de EE. UU. portátil se llenó con gel de EE. UU. desgasificado (Aquasonics) y luego se conectó a la placa base en la cabeza del ratón bajo anestesia ligera usando isoflurano (1–1,5 % de isoflurano). La duración total de esta preparación fue como máximo de 15 min para minimizar el efecto de la anestesia. La profundidad de orientación de EE. UU. (dirección DV) se controló personalizando la altura de la carcasa en forma de cono. La distancia focal del transductor de forma cóncava fue de ~8 mm. La altura de la carcasa del transductor se diseñó para que sea de aproximadamente 3 mm para apuntar al POA y al hipocampo ventral (como un control fuera del objetivo), que se encuentran a una profundidad de 5 mm. La altura de la carcasa del transductor se diseñó para que sea de 7 mm para apuntar a la corteza, que se encuentra a una profundidad de 1 mm. La profundidad focal (relevante para el cráneo) de los EE. UU. portátiles se validó mediante la calibración del hidrófono con el cráneo del ratón ex vivo (datos extendidos, figura 1). Luego se permitió que los ratones se recuperaran de la anestesia y se habituaran a la plataforma de prueba de comportamiento durante aproximadamente 90 minutos antes de la primera estimulación. La instalación de la placa base y el diseño del transductor estadounidense portátil fueron similares en los experimentos con ratas, excepto por la frecuencia central (1,5 MHz en los experimentos con ratas) y las coordenadas de orientación (AP = 0 mm, ML = 0 mm y DV = ~8,5 mm).

La estimulación ecográfica se realizó utilizando los siguientes parámetros: frecuencia fundamental de 3,2 MHz para ratones y 1,5 MHz para ratas, presión acústica negativa máxima (presión in situ considerando la atenuación del cráneo) de 1,6 MPa para ratones y 1,4 MPa para ratas, ciclo de trabajo de 50 %, frecuencia de repetición de pulso de 10 Hz, duración del estímulo de 10 s, intervalo entre estímulos de 30 s, número de estímulo de 6 (ratones) o 20 (ratas). En el estudio de parámetros, se varió la duración del estímulo (2-10 s) y la presión acústica (0,4, 0,8, 1,2 y 1,6 MPa), mientras que otros parámetros se mantuvieron iguales. Para evitar la activación de la vía auditiva por la estimulación de EE. UU., aplicamos una envolvente suavizada al principio y al final de cada forma de onda de EE. UU. utilizando un método previamente informado53. La forma de onda se generó en MATLAB (R2021a, Mathworks) mediante la aplicación de una función envolvente gaussiana al principio y al final de la forma de onda para reducir la generación de componentes de frecuencia de banda ancha. La frecuencia de repetición del pulso fue de 10 Hz, que está fuera del rango de audición del ratón54,55. Luego, la forma de onda programada se introdujo en un generador de funciones (33500B, Agilent), se amplificó a través de un amplificador de potencia (1020L, ENI) y se transmitió al transductor de EE. UU. No se necesitó igualar la impedancia eléctrica porque la parte real de la impedancia del transductor en la frecuencia de resonancia, medida por un analizador de red ENA E5061A con el kit de sonda dieléctrica 85070E (Agilent Technologies), estaba en el rango de 31 a 59 ohmios, que era lo suficientemente cerca de los 50 ohmios necesarios para un ajuste de impedancia perfecto.

La temperatura corporal superficial antes, durante y después de la estimulación con US se registró utilizando una cámara termográfica. Los ratones con el transductor de EE. UU. portátil adjunto se colocaron en una plataforma de prueba de campo abierto, que era una caja de 20 cm (alto) × 10 cm (ancho) × 10 cm (largo). Se colocó una cámara termográfica infrarroja (cámara FLIR E54, FLIR Systems) a 60 cm por encima de la caja para capturar la temperatura corporal del ratón con el software FLIR ResearchIR (v.4). Para garantizar mediciones precisas de la temperatura de la superficie, se eliminó el pelaje de la espalda del animal con unas cortadoras de cabello antes del comienzo del experimento. Este procedimiento de depilación se realizó en todos los experimentos, incluidos los grupos de control US+ y US−. Se colocó una cámara web (C920, Logitech) junto a la cámara térmica para capturar el comportamiento del mouse utilizando el software Bonsai (v.2.7) en sincronización con la cámara térmica. La temperatura ambiente se mantuvo constante a ~22 °C para todos los experimentos. El TBAT se calculó automáticamente usando la combinación de FLIR Tool (v.6.4), Bonsai y el software MATLAB con los siguientes pasos: (1) seguimiento de la ubicación del BAT en Bonsai al estimar que el centro del BAT es el 25 % de la longitud del cuerpo anterior al centroide del cuerpo; y (2) calcular la temperatura media dentro de la región de interés definida por un círculo de 3 mm de radio centrado en la ubicación BAT identificada utilizando MATLAB. La temperatura de la cola se calculó manualmente seleccionando una región circular de interés de 2 mm de diámetro centrada en 1 cm proximal de la cola. El cambio máximo en la temperatura BAT (máx. ∆TBAT) se calculó calculando la diferencia entre la temperatura mínima BAT obtenida dentro del intervalo de 7 a 12 minutos después del inicio de la ecografía y la temperatura corporal de referencia, que se definió como la temperatura corporal media medido 15 min antes de la estimulación de EE.UU. Este cálculo se realizó después de aplicar un filtro de paso bajo a la señal sin procesar para eliminar la fluctuación inducida por la cámara de alta frecuencia y obtener un resultado más preciso.

Para las mediciones de la temperatura corporal central (Tcore), la tasa de consumo de oxígeno (VO2) y las grabaciones de RQ, cada ratón se alojó en una jaula metabólica dentro del Sistema Integral de Monitoreo de Animales de Laboratorio (CLAMS) con control de temperatura (Columbus Instruments). El transductor de EE. UU. se adjuntó a la parte superior de la jaula metabólica con un adaptador de articulación rotatoria para garantizar que el ratón pudiera moverse libremente en la jaula con el transductor de EE. UU. portátil sin la maraña de cables. Los ratones se adaptaron inicialmente a CLAMS durante 1 día antes de cada experimento. Las tasas de consumo de oxígeno (VO2) y producción de dióxido de carbono (VCO2) se midieron utilizando un sensor rápido OxyMax (Columbus Instruments) cada ~3 min con ocho jaulas medidas en serie durante 20 s cada una (18 s de purga de línea aérea; 2 s de medición) y registrado utilizando el Software Estadístico CLAX. A los ratones en las jaulas metabólicas también se les implantaron sensores de temperatura de telemetría (TA-XS, Stellar Telemetry, TSE Systems) para el registro de la temperatura corporal central en sincronización con los registros metabólicos. Los ratones tuvieron acceso ad libitum a comida y agua durante todo el experimento. El cambio máximo en la temperatura corporal central (∆Tcore máx.) se calculó calculando la diferencia entre la temperatura corporal mínima obtenida dentro del período de 30 minutos posterior al inicio de la ecografía y la temperatura corporal de referencia (definida como la temperatura corporal media de los 5 -min ventana que ocurre 1 min antes de la estimulación de EE.UU.). El cambio de tasa de consumo de oxígeno máximo (máx. ΔVO2) se calculó utilizando el mismo método. El ΔRQ máximo se calculó determinando la diferencia entre el RQ más bajo observado dentro de la ventana de 45 a 55 minutos después del inicio de la ecografía y la tasa metabólica basal, que se definió como el RQ promedio medido dentro de una ventana de 28 minutos que ocurrió 2 minutos antes el estímulo estadounidense. Se excluyó un ratón de la curva Tcore en la Fig. 2c debido a un registro incompleto resultante de la falla del sensor de telemetría. El inicio fue el momento en que el Tcore o el VO2 fueron inferiores al umbral, definido como el valor medio de la línea de base: 2 × sd de la línea de base. El tiempo final de la UIH fue el momento en que Tcore volvió a 34 °C. La duración total de la UIH se definió entonces como el período de tiempo desde el inicio hasta el final de la UIH. Se registró un ECG usando el sistema ECGenie (Mouse Specifics) en ratones despiertos. La frecuencia cardíaca se analizó utilizando el software de análisis de señales EzCG (v.7.0, especificaciones del ratón). Para probar el efecto UIH en diferentes temperaturas ambientales, configuramos la temperatura en el sistema CLAMS para que se mantenga en ~6 °C, ~22 °C o ~30 °C. Los ratones se adaptaron inicialmente a CLAMS a la temperatura ambiente preestablecida durante 1 día antes del experimento. Después de la adaptación, se administró estimulación de EE. UU. a los ratones utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente cuando los ratones estaban en la temperatura ambiente específica (6 °C, 22 °C o 30 °C).

El aumento de la temperatura cerebral inducido por ecografía se midió mediante termometría de RM in vivo con un escáner de RM de 4,7 T (Agilent/Varian DirectDrive Console) con un método similar al descrito en el artículo anterior34. Las imágenes de fase se adquirieron utilizando una secuencia de imágenes de eco de gradiente aplicada continuamente con un ángulo de giro de 20°, TR de 10 ms y TE de 4 ms, espesor de corte de 1,5 mm y tamaño de matriz de 128 × 128 para un campo de 60 × 60 mm de vista. Las imágenes de fase se procesaron en tiempo real utilizando el software ThermoGuide (v.1.3.4, terapia guiada por imágenes) para producir imágenes de temperatura basadas en el método de cambio de frecuencia de resonancia de protones. El aumento de temperatura dentro de la sonda del transductor de EE. UU. se midió con un termómetro de fibra óptica (Luxtron, ahora LumaSense Technologies). El termómetro de fibra óptica se insertó en el cono del transductor de EE. UU. y se colocó encima de la cabeza del ratón y debajo del material piezoeléctrico para medir el aumento de temperatura de la sonda del transductor.

El sistema de control de retroalimentación se desarrolló utilizando un controlador de retroalimentación (MATLAB y un microcontrolador Arduino UNO R3 de código abierto), un elemento sensor (el sensor de temperatura corporal central de telemetría) y un dispositivo de accionamiento (EE. UU.). El concepto del sistema de control de retroalimentación de circuito cerrado se ilustra en la Fig. 3. El sistema de control de retroalimentación recibió continuamente mediciones de Tcore a intervalos de 1 minuto. Cuando el Tcore > Tset detectado (Tset = 34 °C), el sistema encendió el US (presión acústica negativa máxima de 1,6 MPa; ciclo de trabajo del 50 %; frecuencia de repetición de pulso de 10 Hz; duración del estímulo de 10 s; inter- intervalo de estímulo de 20 s, número de estímulo de 6). Cuando Tcore ≤ Tset, EE. UU. estaba apagado. Dado que los ratones necesitaban llevar el transductor de EE. UU. durante mucho tiempo, diseñamos un conector de cable de junta rotativa especial modificado a partir de un anillo deslizante giratorio de 360° (Adafruit) para permitir que el cable del transductor de EE. UU. girara libremente mientras el ratón se movía. El tiempo total de registro fue de 30 h y los ratones recibieron estimulación de EE. UU. controlada por retroalimentación durante 24 h. El agua y la comida eran de libre acceso para los ratones. Para compensar la atenuación acústica adicional resultante de la formación de burbujas en el gel de EE. UU. después de múltiples estimulaciones, la presión acústica se incrementó en un 10 % y el número de estímulos se incrementó a 8 después de 12 h de estimulación. Los pesos de los ratones y la comida en la jaula se midieron antes y después del experimento.

Las actividades neuronales evocadas por EE. UU. en las regiones POA y DMH se investigaron mediante el registro de fotometría de fibra de señales GCaMP. Un mes antes de la grabación, se inyectó AAV5-Syn-GCaMP6s en la región POA o DMH mediante inyección estereotáctica utilizando las coordenadas determinadas según el Mouse Brain Atlas: DV = −5,0 mm, AP = 0,2 mm y ML = 0,2 mm para el POA ; DV = −5,2 mm, AP = −1,8 mm y ML = 0,2 mm para el DMH. Para registrar en POA, la placa base del transductor de EE. UU. se adjuntó al cráneo del ratón con su orificio central alineado con el orificio perforado durante la inyección del virus. Se implantó una cánula de fibra óptica (MFC_200/245-0.37_6mm_ZF1.25_FLT, Doric Lenses) aproximadamente 200 µm por encima del sitio de inyección a través del orificio de la placa base y se perforó el orificio durante la inyección del virus. Este diseño permitió la alineación de la región focal de EE. UU. y la punta de la cánula dentro del POA. Para registrar en DMH, se implantó una placa base con un orificio a 2 mm descentrado y se insertó la cánula a través de este orificio en el cerebro. Este diseño de placa permitió la estimulación por ultrasonidos a través del centro de la placa que estaba alineado con el POA, mientras que el registro de fotometría se realizó en la región DMH. A continuación, la cánula y la placa base se fijaron y estabilizaron con cemento adhesivo. A continuación, se permitió que los ratones se recuperaran de la cirugía durante 1 semana.

Se construyeron transductores portátiles de EE. UU. para la estimulación simultánea de EE. UU. y el registro de fotometría de fibra mediante la perforación de un orificio de 2 mm de diámetro para insertar la fibra óptica. El orificio estaba ubicado en el centro del transductor para apuntar a POA y 2 mm fuera del centro para apuntar a DMH. El transductor se conectó a la placa base. Se pasó un manguito de acoplamiento a través del orificio del transductor y se conectó la férula de acero inoxidable a la cánula implantada. La fibra transmitió luz azul excitadora (longitud de onda de 470 nm, potencia del 4%) y recolectó fotones emitidos por GCaMP6s. Las señales de GCaMP6s se recolectaron, digitalizaron y midieron con un sistema de fotometría (FP3002, Neurophotometrics) en sincronización con la estimulación de EE. UU. Se utilizó un software de código abierto Bonsai (v.2.7) para adquirir los datos de fotometría y la señal de sincronización de un LED.

Los datos de fotometría se adquirieron antes, durante y después de la estimulación con US. Los datos adquiridos se procesaron utilizando un método adaptado de un método previamente informado56. Los datos primero se decoloraron usando un filtro de paso alto y se convirtieron a puntaje z usando la función 'zscore' de MATLAB. Los picos se identificaron utilizando la función 'findpeaks' de MATLAB. La amplitud máxima, la media de la puntuación z y la frecuencia máxima se calcularon antes de la US (el período de 5 s justo antes de la estimulación con US), durante la US (10 s durante la estimulación con US) y después de la US (el período de 15 s justo después de que finalizó la estimulación con US). ). El tiempo de inicio de la activación neural se determinó como el tiempo desde el inicio de la ecografía hasta el comienzo de una actividad de Ca2+ evocada con éxito, que se definió como puntuación z > (media + 3 × sd) de la anterior a la ecografía.

Además, para verificar las posiciones del transductor de EE. UU. y la fibra óptica, se realizó una resonancia magnética de los ratones utilizando un escáner de resonancia magnética de animales pequeños de 9,4 T (BioSpec 94/20 USR; Bruker BioSpin MRI, Ettlingen). Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2% y se colocaron en una bobina de volumen de RF (Bruker BioSpin MRI). Las imágenes de eco de espín rápido potenciadas en T2 se adquirieron con los siguientes ajustes: TR/TE de 2200/43,53 ms; espesor de corte de 0,25 mm; resolución en el plano de 0,125 × 0,125 mm2; tamaño de matriz de 256 × 256; ángulo de giro de 180°; medias de 8.

Aproximadamente 1,5 horas después de la estimulación con EE. UU., los ratones se sacrificaron mediante perfusión transcardiaca con PBS seguido de paraformaldehído (PFA) al 4%. Los cerebros se recogieron y se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se equilibraron en sacarosa al 30 % (en PBS 1x) para la criosección. Los cerebros fijados se seccionaron en rodajas de 15 µm para la tinción inmunohistoquímica y el análisis de hibridación in situ.

La tinción inmunohistoquímica se realizó con los siguientes anticuerpos primarios: anti-NeuN (Abcam, nº de catálogo 104225, dilución 1:1000), anti-GFAP (Abcam, nº de catálogo 207165, dilución 1:1000), anti-Iba1 ( Abcam, nº de catálogo 178846, dilución 1:1000) y anticuerpo anti-c-Fos (Cell Signaling Technology, nº de catálogo 2250, dilución 1:500). La tinción FISH con el ensayo RNA-scope se realizó siguiendo el protocolo del fabricante para el kit RNA-scope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics (ACD), 323110). Las sondas de alcance de ARN utilizadas fueron Mm-FOS (ACD, 316921), Mm-Adcyap1-C2 (ACD, 405911-C2) y Mm-Trpm2-C3 (ACD, 316831-C3).

Se obtuvieron imágenes de los cortes de cerebro teñidos utilizando el microscopio multicanal Keyence BZ-X800 con un objetivo ×20 y el software BZ-X800 Analyzer (Keyence Corp). Para cuantificar el porcentaje de células positivas en diferentes regiones del cerebro, los cortes de cerebro se registraron con el Allen Brain Atlas basado en un método de registro semiautomático en MATLAB informado anteriormente57. La intensidad de fluorescencia promedio de los marcadores de proteína o ARN se calculó dentro del área celular estimada y se determinó que era positiva si era mayor que la media + 3 × sd del fondo de todo el cerebro.

Aproximadamente 1 h después de la estimulación con EE. UU., los ratones se perfundieron transcardiacamente con solución salina tamponada con fosfato helada (1x PBS). La región POA de los ratones tratados con US (US+, n = 4) y los ratones simulados (US-, n = 4) se extrajo de cada cerebro y se homogeneizó en un homogeneizador Dounce (Kimble) que contenía 0,4 ml de tampón de extracción nuclear recién preparado. (sacarosa 250 mM, KCl 25 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), Triton X-100 al 0,1 % y inhibidor de la ribonucleasa recombinante 0,2 U μl−1 (Invitrogen RNaseOUT)) aplicando cuatro golpes con el mortero A seguido de ocho golpes con el mortero B. El homogeneizado de cuatro ratones del grupo de control y cuatro ratones del grupo de EE. UU. se combinó para el aislamiento del núcleo. Las muestras se filtraron a través de un tubo colador de células de 30 µm (Corning Falcon) y se centrifugaron a 500 g durante 5 min a 4 °C para precipitar los núcleos. Los núcleos disociados se lavaron una vez y se resuspendieron suavemente con tampón de almacenamiento nuclear (PBS con 1% de BSA y 0,2 U μl-1 de inhibidor de ribonucleasa recombinante). Para purificar los núcleos de las neuronas para RNA-seq de un solo núcleo, la suspensión de núcleos se incubó con anticuerpo anti-NeuN de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Millipore sigma, MAB377X, dilución 1:200) durante 30 min en hielo. Después de la incubación, los núcleos se lavaron una vez y se resuspendieron con tampón de almacenamiento nuclear con 1 μg ml−1 de DAPI. Las muestras se filtraron a través de un tubo de filtro de células de 30 µm y se clasificaron brevemente usando FACS (MoFlo, Beckman Coulter) usando el software FlowJo (v.10.8) con una estrategia de selección específica (Fig. 1 complementaria). Los núcleos de las neuronas se clasificaron en núcleos DAPI+/NeuN+ y se recogieron en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Se recolectaron aproximadamente 25 000 núcleos de neuronas de cada uno de los grupos de control y de EE. UU. y se enviaron a GTAC@MGI para RNA-seq de una sola célula (10x Genomics). Con un kit Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ GEM, Library and Gel Bead v.3.1 (10x Genomics), los núcleos de las neuronas se cargaron inmediatamente en un procesador Chromium Single Cell (10x Genomics) para el código de barras de ARN de núcleos individuales. Las bibliotecas de secuenciación se construyeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las muestras de ADNc resultantes se analizaron en un Agilent Bioanalyzer utilizando el chip de ADN de alta sensibilidad para determinar las concentraciones de ADNc. Las muestras se combinaron y se procesaron en un Illumina Nova Seq 6000.

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron con la canalización 10x Genomics CellRanger (v.6.1.1) basada en el genoma del ratón de referencia (mm10-2020-A) con parámetros predeterminados. Los datos se normalizaron a la muestra saturada más baja, lo que llevó a 83 113 lecturas (media), 3207 genes (mediana) y 7353 recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) (mediana) por célula en el grupo de control (n = 4 ratones). El grupo UIH (n = 4 ratones) contenía 77 898 lecturas, 2998 genes y 6498 recuentos UMI por célula.

El paquete Seurat (v.4.0) en R studio (R v.4.2) se usó para procesar los datos de RNA-seq de un solo núcleo. Primero se filtraron los datos con los siguientes criterios. Se consideró que las células que tenían recuentos mitocondriales > 5 % exhibían una contaminación mitocondrial extensa y se filtraron. Las celdas que tenían recuentos de características únicas > 7500 se consideraron como dobletes o múltiplos y se filtraron. También se filtraron las celdas que tenían recuentos de características únicas <200. Después de filtrar, se fusionaron todos los objetos de Seurat. Para la normalización se utilizó el método 'LogNormalize' con un factor de escala de 10.000. La función 'FindVariableFeatures' se usó para extraer las 4000 principales características variables. Los datos se escalaron según el porcentaje mitocondrial utilizando la función ScaleData. Los IEG podrían afectar potencialmente el agrupamiento. Por lo tanto, eliminamos los 139 IEG58 de la lista de genes característicos antes de la siguiente canalización de procesamiento de datos. A continuación, se llevó a cabo un análisis de componentes principales utilizando la función 'RunPCA'. Usando los 40 componentes principales principales, la función 'The FindNeighbours' y 'FindClusters' se utilizaron para identificar los 34 clústeres iniciales. Los resultados de la agrupación se visualizaron utilizando gráficos UMAP.

Las agrupaciones identificadas como células neuronales se usaron para un análisis posterior al verificar el nivel de expresión promedio de Kif5c y Camk2a58. Un total de 21.886 de 22.612 se identificaron como células neuronales. La función 'FindAllMarkers' se usó para encontrar genes significativos en cada grupo. La población neuronal se procesó adicionalmente para identificar subtipos neuronales repitiendo los métodos antes mencionados. La agrupación identificó 11 tipos de células neuronales excitatorias y 24 inhibitorias. Se utilizó la construcción de árboles jerárquicos en las neuronas excitatorias para identificar las neuronas asociadas al letargo sobre la base de las características informadas anteriormente, incluidas Adcyap1, Qrfp y Esr1 (refs. 11,12,15) basadas en el agrupamiento de k-medias. Los niveles de expresión promedio de los canales iónicos TRP y PIEZO, que se resumieron de la literatura anterior59,60,61, se examinaron en todos los grupos asociados al letargo.

Se usaron partículas lentivirales que contenían shRNA Trpm2 (m) (n.º de cat. sc-42675-V, Santa Cruz Biotechnology) para eliminar la expresión de los canales iónicos TRPM2 y partículas lentivirales que contenían shRNA codificado (m) (n.º de cat. sc- 108080, Santa Cruz Biotechnology) como control. Luego, se microinyectaron 1,5 µl de solución de shRNA (106 unidades infecciosas de virus) en la región POA bilateralmente (3 µl de volumen total). La inyección se realizó tres veces cada 3 días para asegurar un número suficiente de partículas lentivirales en el POA. Tres semanas después de la primera inyección, los ratones recibieron estimulación por ultrasonidos en la región POA como se describió anteriormente. Se realizó Western blot para evaluar el nivel de expresión de TRPM2 en la región POA en el grupo de eliminación y se comparó con el del grupo de control al que se inyectó shRNA codificado.

Para examinar la sensibilidad ecográfica del canal iónico TRPM2, utilizamos nuestro método de obtención de imágenes de calcio in vitro previamente informado34. Las células HEK293T (CRL-3216, ATCC) se cultivaron en DMEM (4,5 g l-1 de glucosa), suplementadas con 10 % de FBS, 2 mM de l-glutamina, 100 μg ml-1 de piruvato de sodio, 1 % de aminoácidos no esenciales y 1 % pen-strep. El canal de iones TRPM2 se sobreexpresó en las células utilizando Lipofectamine 2000. Un día antes de la transfección, se sembraron células a 0,5–1 × 105 en 500 μl de medio de cultivo sin antibióticos en una placa de 48 pocillos en pocillos alternos. Luego, primero se mezclaron 2 μl de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) con 0,8 μg de plásmido de ADN Trpm2 (Plasmid 53920, Addgene) en 50 μl de Opt-MEM. Luego, se agregaron 50 μl del complejo a las células para permitir la transfección de 2 días antes de aplicar la estimulación con US. Se utilizó Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific), un indicador de Ca2+, para obtener imágenes de la dinámica espacial de la respuesta de Ca2+ a la estimulación de EE. UU. mediante un microscopio de fluorescencia a una velocidad de fotogramas de 2,4 fotogramas s−1 con Q-capture (pro 7) software. La expresión funcional de TRPM2 se validó observando la señal de Ca2+ en respuesta al agonista ADPR (concentración final 100 μM, sal sódica de adenosina 5′-difosforribosa, A0752-25MG, Sigma-Aldrich). A los 30 s después del inicio de la grabación, se aplicó estimulación de EE. UU. (frecuencia de 1,7 MHz, presión acústica de 1,0 MPa, ciclo de trabajo del 40 %, PRF de 10 Hz, duración de 60 s) a las células utilizando la configuración de estimulación de EE. UU. personalizada como se describe en nuestro estudio previo34. No utilizamos el mismo parámetro de EE. UU. que el protocolo de estimulación de EE. UU. in vivo debido a la diferencia en los transductores de EE. UU. El tiempo de inicio de la activación de las células TRPM2+ se definió como el tiempo desde el inicio de la ecografía hasta el comienzo de una actividad de Ca2+ provocada con éxito, que se definió como ΔF/F > (media + 3 × sd) de la señal antes de la estimulación con ecografía. . La temperatura de la cámara de cultivo celular se controló utilizando un termómetro de fibra óptica. La punta del termómetro de fibra óptica se insertó en un lugar aproximadamente 1 mm cerca del foco del transductor para evitar la interferencia de la propagación de la onda de EE. UU. Para el estudio del bloqueador, se añadieron 5 µl de antagonista 2-APB (TOCRIS) a 500 µl de solución de cultivo celular hasta una concentración final de 30 µM 1 min antes de la estimulación con US.

El análisis estadístico se realizó en GraphPad (Prism) y los métodos de análisis estadístico se indican en cada pie de figura. Las diferencias estadísticas se consideraron significativas cuando P < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos presentados en este estudio están disponibles en la Fuente de datos. Se puede acceder a los conjuntos de datos originales utilizados en el análisis de secuenciación de ARN de un solo núcleo en NCBI, archivados con el código de acceso GSE228180 de Gene Expression Omnibus. El atlas del cerebro de ratones utilizado en este estudio está disponible en Allen Brain Atlas. La información adicional y las solicitudes de recursos y reactivos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a JD Quirk por ayudar con el problema técnico del escáner de resonancia magnética. Agradecemos a L. Li de la Universidad de Washington, C.-K. Mo y X. Liu por proporcionarnos valiosas sugerencias sobre el análisis de datos de RNA-seq de un solo núcleo. También agradecemos a A. Norris y A. Cone por ayudarnos a configurar imágenes de temperatura corporal con una cámara térmica. Agradecemos a M. Rhodes por ayudarnos a obtener imágenes de los cortes teñidos con FISH. Algunas de las caricaturas fueron creadas con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por NIH R01MH116981 (HC), UG3MH126861 (HC), R01EB027223 (HC) y R01EB030102 (HC). JRB cuenta con el apoyo de NIH DP5 OD028125 y Burroughs Wellcome Fund CAMS no. 1019648.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Washington en St. Louis, Saint Louis, MO, EE. UU.

Yaoheng Yang, Jinyun Yuan, Dezhuang Ye, Zhongtao Hu, Kevin Xu, Lu Xu, Yan Gong, Yimei Yue, Jianmin Cui y Hong Chen

Departamento de Patología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

Rachael L. Field y Jonathan R. Brestoff

Departamento de Psiquiatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

Alexxai V Kravitz

Departamentos de Anestesiología y Medicina del Dolor, Farmacología y Bioingeniería, Centro de Neurobiología de la Adicción, el Dolor y las Emociones, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Michael R. Bruchas

Departamento de Oncología Radioterápica, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

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Departamento de Neurocirugía, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, EE. UU.

hong chen

División de Neurotecnología, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

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La conceptualización estuvo a cargo de HC e Y. Yang. El diseño del experimento estuvo a cargo de HC, Y. Yang, JRB y MRB La implementación del experimento estuvo a cargo de Y. Yang, JY, RLF, DY, ZH, LX, KX, Y. Yue y YG La investigación de resultados estuvo a cargo de HC, Y. Yang, JY, AVK, MRB y JRB La visualización fue realizada por HC e Y. Yang. La adquisición de fondos estuvo a cargo de HC La administración del proyecto estuvo a cargo de HC La supervisión estuvo a cargo de HC, JRB, MRB y JC La redacción del borrador original estuvo a cargo de HC y Y. Yang. La revisión y edición estuvo a cargo de HC, Y. Yang, JC, JY, RLF, DY, ZH, YG, KX, AVK, MRB y JRB.

Correspondencia a Hong Chen.

JRB tiene solicitudes de patentes pendientes que no están relacionadas con el estudio actual. Específicamente, se relacionan con la transferencia de mitocondrias para el tratamiento de enfermedades asociadas con la disfunción mitocondrial, un enfoque terapéutico para enfermedades alérgicas y un método para superar los efectos de gancho en inmunoensayos. JRB ha sido consultor de DeciBio y Flagship Pioneering en los últimos 12 meses y forma parte del Consejo Asesor Científico de LUCA Science. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Metabolism agradece a Gerhard Heldmaier, Martin Jastroch, Takeshi Sakurai y Elsa Fouragnan por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Christoph Schmitt, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(A) Ilustración del transductor de ultrasonido portátil. El transductor estaba unido a una placa base que estaba pegada a la cabeza del ratón. Fotos de la sonda de ultrasonido (sonda de EE. UU.) y la placa base. También se proporciona una foto del inserto de la placa base. El inserto de la placa base con un orificio en el centro se usó durante la instalación de la placa base para guiar el posicionamiento de la placa base. El inserto se quitó después de la instalación de la placa base. (B) La configuración experimental para medir los campos de presión acústica generados por la sonda de ultrasonido usando un hidrófono en un tanque de agua desgasificada. El cráneo de ratón ex vivo con la placa base se colocó frente a la sonda de ultrasonido. (C) Los campos de presión acústica medidos en el plano focal axial y el plano focal lateral en presencia del cráneo del ratón. El tamaño de la región focal medido por el ancho total a la mitad del máximo fue de 3,8 mm en la dirección axial y de 0,8 mm en la dirección lateral.

(A) Cambio de temperatura corporal central inducido por UIH (máx. ΔTcore) y cambio de la tasa metabólica (máx. ΔVO2) en ratones hembra (rosa) y macho (azul). En el gráfico de la izquierda, n = 6 ratones macho en los grupos US+ y US− y n = 7 ratones hembra en el grupo US+ y 8 ratones hembra en el grupo US−. En el gráfico de la derecha, n = 5 ratones en todos los grupos. (B) Correlación temporal de VO2 y Tcore inducida por estimulación con ultrasonido. La sonicación de EE. UU. se indica mediante la barra rosa. (C) Comparación del tiempo de inicio de VO2 y Tcore. N = 7 ratones. (D) Cuantificación de la duración del estado hipotérmico. N = 7 ratones. (E) Cuantificación del tiempo de recalentamiento (desde el Tcore más bajo hasta 34 °C) en grupos que reciben una sola estimulación de EE. UU. y que reciben estimulación de ultrasonido controlada por retroalimentación de larga duración. N = 7 ratones para el grupo de estimulación con EE. UU. único y 4 ratones para el grupo de estimulación con ultrasonido controlado por retroalimentación. Las barras de error denotan sem Cada punto representa un ratón. Los valores de P se calcularon utilizando una prueba t de dos colas no pareada en (A y E) y una prueba t de dos colas pareada en C.

Datos fuente

Cambio de la temperatura corporal central en relación con la línea base (ΔTcore) y el ΔTcore máximo calculado para los cuatro grupos, incluido el grupo sin estimulación con ultrasonido (US−), el grupo que recibe estimulación con ultrasonido en el POA (POA), el grupo fuera del objetivo grupo de control que recibe ultrasonido en la corteza (Corteza), y el grupo de control fuera del objetivo que recibe ultrasonido en el hipocampo ventral (Hippocampus). En la figura de la derecha, el ΔTcore máximo se calculó como el Tcore más bajo: el Tcore medio antes de la ecografía. La sonicación de EE. UU. se indica mediante la barra rosa. Las líneas sólidas y las sombras indican la media ± sem. Las barras de error indican sem. Cada punto representa un ratón. N = 8 ratones en el grupo US, 7 ratones en el grupo POA, 4 ratones en el grupo Cortex y 6 ratones en el grupo Hippocampus. Los valores de P se calcularon usando un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Dunnett comparando cada grupo con US-.

Datos fuente

Evaluación de la morfología y el número de neuronas, astrocitos y microglia después de la estimulación con ultrasonido en el POA. Las barras de error denotan sem Cada punto representa un ratón. N = 5 ratones. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos colas no pareadas.

Datos fuente

(A) Temperatura corporal central (Tcore) y (B) tasa metabólica (VO2) para ratones que reciben estimulación por ultrasonido en diferentes temperaturas ambientales (6 °C, 22 °C y 30 °C). La sonicación de EE. UU. se indica mediante las barras rosas. Las líneas sólidas y las sombras indican la media ± sem. Las barras de error indican sem. Cada punto representa un ratón. Max ΔTcore y max VO2 se calcularon calculando la diferencia entre el valor mínimo obtenido dentro del período de 70 min después del inicio de la ecografía y el valor de referencia que se definió como la temperatura corporal media de la ventana de 5 min que ocurre 1 minuto antes de la ecografía. estimulación por ultrasonidos. N = 4 ratones para todos los grupos. Los valores de P se calcularon utilizando un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Dunnett en comparación con el grupo de temperatura ambiente de 22 °C.

Datos fuente

Izquierda: tinción de inmunofluorescencia de la proteína c-Fos en el cerebro estimulado con ultrasonido (US+) y el cerebro no sonicado (US-). Derecha: porcentaje de células c-Fos+ entre todas las células en la región POA objetivo al comparar los grupos US+ y US−. N = 5 ratones para el grupo US+ y 4 ratones para el grupo US−. Las barras de error indican sem Los valores P se calcularon utilizando pruebas t de dos colas no apareadas.

Datos fuente

Evaluación de transferencia Western del nivel de expresión de TRPM2 en ratones simulados que recibieron la inyección de virus de control (Sham) y ratones que recibieron inyección de Lentivirus-Sh-RNA para eliminar la expresión de TRPM2 (TRPM2-KD). Las barras de error indican sem N = 4 ratones para el grupo TRPM2-KD y 5 ratones para el grupo Sham. Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t de dos colas no apareadas.

Datos fuente

Cuantificación de la tasa de cambio de la temperatura corporal (tasa máxima de ΔTcore) y la tasa de cambio de VO2 (tasa máxima de ΔVO2) durante la entrada (A) y la activación de UIH (B) para los grupos WT y UCP1-KO. Las barras de error denotan sem Cada punto representa un ratón (hembra). N = 6 ratones para el grupo WT y 5 ratones para el grupo UCP1-KO. Los valores de p se calcularon utilizando pruebas t de dos colas no apareadas.

Datos fuente

(A) (Izquierda) Imagen de termometría de RM de vista coronal del calentamiento inducido por ultrasonido en el cerebro del ratón in vivo. La línea blanca continua describe el cerebro del ratón y las líneas punteadas ilustran el haz de ultrasonido. (Derecha) Cambios de temperatura dentro de la región POA dirigida por ultrasonido (ΔTTarget) en función del tiempo. (B) (Izquierda) El tiempo de inicio de la activación neural se calculó a partir del registro de fotometría de fibra de la actividad de Ca2+ en el POA durante la estimulación con US (Fig. 4). (Derecha) El ΔTTarget correspondiente en el momento de inicio de la activación neuronal. Las líneas continuas y las sombras indican la media ± sem. Cada punto representa una estimulación de ultrasonido de 10 s.

Datos fuente

(A) Cambios de temperatura en la cámara de cultivo celular (ΔTchamber) en función del tiempo. (B) (Izquierda) El tiempo de inicio de la activación de las células TRPM2+ se calculó a partir de las imágenes de fluorescencia Ca2+ de células HEK293 in vitro con sobreexpresión de TRPM2 (Fig. 6). (Derecha) El ΔTchamber correspondiente en el momento de inicio de la activación de TRPM2. Las líneas sólidas y las sombras indican la media ± sem. Cada punto representa una celda.

Datos fuente

Estrategia de activación de citometría de flujo.

Video representativo de imágenes térmicas infrarrojas de un ratón que recibe estimulación ultrasónica no invasiva en el POA.

Fuente de datos estadísticos.

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Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Yang, Y., Yuan, J., Field, RL et al. Inducción de un estado hipotérmico e hipometabólico similar al letargo en roedores mediante ultrasonido. Nat Metab 5, 789–803 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

Descargar cita

Recibido: 29 de octubre de 2022

Aceptado: 11 de abril de 2023

Publicado: 25 mayo 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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